用于转染和单细胞培养的化学限定培养基

2015年第24届欧洲动物细胞技术学会年会

题目：用于转染和单细胞培养的化学限定培养基

BMC Proceedings20159 (Suppl 9) :P27

https://doi.org/10.1186/1753-6561-9-S9-P27

背景

先进的培养基和补料开发已经多次证明了其提高生物工艺效率的潜力。通过应用这种先进的化学限定和无动物成分配方，结合最新的细胞系，哺乳动物细胞培养物的产量被推进到每升2克。本文介绍了用于转染和单细胞生长的专用培养基的设计进展。瞬时转染在基础科研、药物原料生产、个体医学和疫苗生产上都有应用。瞬时基因有效表达的规模升级，需要同时支持细胞生长和转染的双功能培养基。

材料与方法

在96孔板中观察了化学限定的无动物源培养基对单细胞生长的影响，并与含血清培养基进行了比较。单细胞的生长通过Cellavista高通量细胞成像和分析工作站进行分析，并对不同的CHO细胞系进行了克隆选择和规模升级（扩大到转瓶培养）。亚克隆细胞表达的重组蛋白分离后用ELISA定量，并进行了活性测定。

对瞬时转染，开发的培养基配方在CHO细胞和人细胞系上进行了测试。转染效率用阳离子多聚体转染试剂盒和GFP表达质粒进行评估。对转染后采用分批培养、流加培养和伪灌注培养的HEK细胞系表达IgG1抗体进行了调查，蛋白A联合HPLC进行抗体定量。被阳离子试剂转染的细胞密度通常为3×106细胞/ml，表达GFP或IgG1的质粒为2pgDNA/细胞。转染期间细胞培养体积为4ml~1000ml。

结果

结果显示，不同的单细胞能成功的从96孔板扩增至24孔板，再到细胞培养瓶和转瓶。采用有限稀释法得到的细胞存在个体差异，所筛选的细胞克隆表现出不同的生长和表达性能。8个有代表性的细胞克隆最高密度为1.9×106/ml至8.5×106次方/ml，表达的蛋白产量和活性存在3倍的差异。无动物源细胞培养基对应的克隆效率仍高于含血清的培养基。

对于瞬时转染，研发的HEK转染培养基支持稳定的细胞生长，使分批培养的细胞保持高密度（最高为16X106 细胞/ml）和高存活率，在转染时使用新鲜培养基，对于不同的HEK细胞系，转染效率为68%-94%。对于一种待评估的CHO细胞系，效率达75%-92%（见图1A）。成功的小规模伪灌注培养显示该方法的可行性，并且可应用于生物反应器。对于不稳定的产物如特异性的酶，该灌流过程令人关注。瞬时转染用的一款商品化培养基培养的细胞表达的单克隆抗体滴度为90-150mg/L，而用研发的Xell培养基，可使单抗滴度升高至310-430mg/L,平均升高了3.1倍。在转染后使用优化的流程和合适的培养基，可使产量进一步升高至750 - 850 mg/L。和对照的培养基相比，升高了6.7倍（见图1B）。

图1. 转染效率总览。A. 使用开发的Xell培养基。尽管该培养基专为HEK细胞设计，但对另一种人细胞系和CHO-K1也支持高效转染。B. 转染基因表达的单克隆抗体量。Xell开发的培养基和一款商品化培养基进行了比较。