细胞状态不好，你排除过支原体吗？（上）

1、支原体的分离培养

  它是支原体污染鉴定的金标准，准确，价格便宜。但支原体在分离培养的过程中，要长出明显克隆至少需要4周时间，所需时间较长。

2、ELISA方法

  检测步骤复杂，出现误差的几率较高，对实验者操作技巧有要求。同时试剂盒成本较高，普遍不被选用。

3、DNA荧光染色法

  它采用荧光染色剂Hoechst 33258和支原体DNA富含A-T的区域结合。价格适中。由于DNA检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天后才出结果。有假阳性和假阴性，需要与其他方法结合使用。

4、PCR技术

它根据支原体核糖体16s-23s rRNA的特异保守序列设计引物，对待检样本DNA进行扩增，通过对扩增产物的大小分析作出诊断（见下图）。操作简单、速度快，只需2-3小时即可出结果，通量高，价格适中。但是，不同厂家生产的PCR检测试剂盒由于引物及内在设计的不同，其准确度和敏感度有天壤之别。

目前，被全球各大实验室及生物药厂普遍选用的是德国Minerva Biolabs公司开发生产的支原体PCR检测试剂盒。试剂盒在267bp的条带，涵盖了欧洲《药典》中最易感染细胞的26种支原体亚型，保证了其超强的敏感度；通过内控条带的设计，防止了假阴性的发生。我国农业部在2008年猪蓝耳病疫苗研制的重点项目中，实验者用此检测法与培养法做了超过100次的平行比对实验，结果全部一致，假阳性率和假阴性率为零。

因此，用PCR方法检测支原体，其准确性与选择的试剂盒的质量有直接相关性。

图：有支原体污染的样本在267bp位置有阳性条带。Internal Control为内部对照，在190bp，保证PCR反应的正常。