制药企业洁净室的污染源及鉴定

制药企业洁净室的微生物污染源及鉴定

制药企业洁净室常需进行环境微生物的监控，以确保生产环境的洁净以及不会造成药品的污染。制药企业洁净室常见的污染源如下（据中国食品药品检定研究院在2018年全国药品微生物检验控制技术精要培训班上的讲座ppt）：

1、人。携带的微生物主要有：金葡、表葡、八叠球菌、不动杆菌、产碱杆菌、亲脂性酵母、皮肤真菌等。

2、空气。携带的微生物主要有：微球菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、棒状杆菌、曲霉、青霉。

3、设备、墙面、地面表面。存留的微生物主要有：假单胞菌、表葡、芽孢杆菌等。

4、原材料及包装材料。携带的微生物有：乳杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链球菌、梭菌、霉菌（枝孢属、青霉属、曲霉属）。

5、水。水中的微生物主要有：假单胞菌、产碱杆菌、寡养单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、皮氏伯克霍尔德菌、甲基杆菌属、沙雷氏菌、黄杆菌等。

许多企业为了鉴定菌种，常将大量资金用于微生物全自动鉴定仪器和相关试剂的购买。其实，一些微生物生化鉴定试剂盒（无须软件和仪器）、鉴别培养基和PCR试剂盒即可完成常见菌种的鉴定工作。

对于以上红色标出的菌种或菌属，已知均可用HiMedia生产的生化鉴定试剂盒去作鉴定。其生化鉴定试剂盒包含有生化鉴定卡及辅助试剂，每个生化鉴定卡上有12个孔，预置相关的培养基和生化试剂，对应12种生化反应。反应完成后，通过试剂盒内提供的结果诠释表和菌种标准表，即可人工完成菌种鉴定。其试剂盒覆盖大部分常见菌种，准确度高，在欧盟和美国FDA均有产品注册。

上面的常见菌群中，金葡、表葡可用葡萄球菌的生化鉴定试剂盒（货号KB004）进行鉴定，不动杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌均有相应的生化鉴定试剂盒。假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌可用非发酵菌生化鉴定试剂盒（货号KB019）进行鉴定。沙雷氏菌属于肠杆菌科，可用肠杆菌科的生化鉴定试剂盒（货号KB003）进行鉴定。

对于黄色部分的菌种：寡养单胞菌，又称嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，旧名“嗜麦芽假单胞菌”。它和皮氏伯克霍尔德菌、黄杆菌均可用非发酵菌试剂盒进行鉴定。

对于蓝色部分的菌种：

1、微球菌属。最常见为藤黄微球菌（Micrococcus luteus）。其为革兰氏阳性，与葡萄球菌近似，菌落光滑，颜色呈黄或红色。为条件致病菌，广泛存在于自然界。《伯杰氏细菌鉴定手册》指出，其接触酶阳性，无运动性，可利用乙酸盐、乳酸盐和丙酸盐，不产生吲哚。依据生化特征鉴别藤黄微球菌时，主要依据其在含糖的复杂培养基上好氧的生长而不产生可察觉的酸。其菌落呈黄色、黄绿色或橙色。具体鉴定，可采用如下方案：1）先革兰氏染色，观察镜下形态，如为球形，革兰阳性，且疑为葡萄球菌或微球菌。2）可采用“葡萄球菌和微球菌发酵培养基”（英文名Fermentation HiVeg Medium for Staphylococcus and Micrococcus，货号#MV827），以区分微球菌和葡萄球菌。其原理是，培养基中包含葡萄糖，葡萄球菌能厌氧产酸，而微球菌不能。培养基含有的溴甲酚紫为pH指示剂，可指示产酸带来的pH变化。该液体培养基含有少量琼脂，因而创造出厌氧环境。培养18-24小时后，如果是藤黄微球菌，则反应管没有颜色变化，而葡萄球菌的管变为金黄色。

2、八叠球菌属：属于消化球菌科，细胞球形，呈八个或更多细胞的立方堆状。可形成芽孢，革兰阳性。可发酵葡萄糖，产酸，专性厌氧，在pH1到9.8均可生长。无接触酶。镜下应不难辨认。

对于产碱杆菌，它与产碱假单胞菌非常近似，它的鉴别特征是在含有蛋白胨的肉汤培养基中产氨，使pH上升。粪产碱杆菌最常见，它在碳水化合物培养基上呈强烈的产碱反应。木糖氧化产碱杆菌使OF葡萄糖培养基和OF木糖培养基产酸。本菌能还原亚硝酸盐，而不能还原硝酸盐。因而，采用OF基础培养基（英文名：OF Basal HiVegTM Medium，货号MV395）和相应的糖溶液可鉴别产碱杆菌。

对于棒状杆菌，它属于革兰氏阳性大杆菌，接触酶阳性。可采用碲酸盐血琼脂平板进行分离培养，棒状杆菌菌落呈灰黑色。

对于甲基杆菌，可采用PCR 法扩增菌株的16S rDNA 和甲醇脱氢酶大亚基的 mxaF 基因，扩增产物进行测序，在NCBI数据库中用BLAST 进行比对，并用MEGA4.0软件进行系统进化树分析。甲基杆菌为革兰阴性，氧化酶和接触酶阳性。

对于梭菌，大部分为严格厌氧菌。在《伯杰细菌鉴定手册》中给出了一个表，主要根据糖发酵来鉴定梭菌属内的各个菌种。HiMedia公司提供了一种包含35种糖发酵的试剂盒（货号KB009），因而可用于梭菌的鉴定。

对于真菌，如亲脂性酵母和霉菌（枝孢属、青霉属、曲霉属），首先从形态上可区分细菌，也可区分酵母和霉菌，霉菌常常有丝状菌丝。不同霉菌，有些从形态上也可区分。青霉菌属帚状枝是根据青霉菌属特征性结果，根据菌落特征、分生孢子梗、帚状枝、瓶梗和分生孢子形态特征，就可鉴定到属甚至种水平。曲霉具有有隔菌丝、分生孢子梗和特殊的分生孢子头结构，易与其他菌属真菌区别。还可根据SDA或PDA平板上生长的快慢、菌落形态、分生孢子梗等进一步鉴别。HiMedia也提供了一款鉴别培养基，货号M1127，可区分巴西曲霉、黄曲霉和寄生曲霉。

总之，对于制药企业洁净室的常见菌，通过形态染色、生化鉴定（可采用市面上提供的生化鉴定试剂盒）、PCR产物测序等手段，已足以满足鉴定的需求，从而完成溯源和诊断的任务。