细胞状态不好，你排除过支原体吗？(下）

   细胞培养过程中，由于实验环境、操作者鼻腔口腔、实验器材等很多地方都有支原体的存在。因此，细胞发生支原体污染的频率很高。

       据美国数据统计，细胞发生支原体污染的几率在70%以上。

       同时，由于支原体直径很小，仅在180nm~350nm之间，只有通过电镜才能看到。因此，支原体污染不易被实验者肉眼发觉。

       而支原体污染是个循序的过程，普通抗生素对其无效。因此，被支原体污染的细胞会持续受到影响，导致实验数据不准确。

      为什么有些细胞实验无法重复？

      为什么有的细胞在相当长的时间里，都养不到**状态？

      为什么实验室中，超过一株以上的细胞都时好时坏？

      支原体污染是一个很重要的原因！

       在本公众号上周《细胞状态不好，你排除过支原体吗(上)》这篇文章里，笔者详述了细胞被支原体污染的症状及检测方法。

       本期文章中，我们将进一步介绍细胞被支原体污染后，彻底清除支原体的方法。

细胞被支原体污染，解决方案

方法一：确认细胞已被支原体污染，终止试验，丢弃所有被污染的细胞和耗材。

       重新复苏细胞，注意选用未被污染的细胞株、血清和培养基，并规范操作。

方法二：对于珍贵的，样品不可再得的细胞，或价格昂贵的种子细胞，不但无法丢弃，而且作为种子细胞，还需要彻底根除支原体污染。

      此时，需选用特异性的支原体杀除剂，清除污染，保护细胞。

      目前世界上最有效的方法是是德国的一款**生物试剂，由Minerva公司生产，品名Mynox^?。

      此试剂可在2-3小时内将支原体主动杀除，但对细胞无毒害作用。特别适合细胞保种。

      Mynox^?为枯草杆菌中提取出的生物制剂，加入培养液中，可特异性地与支原体膜结合，改变膜通透性。通过此生物物理的方法，2～3小时内，即可把细胞中的支原体杀除掉。因为细胞膜结构与支原体膜不同，故Mynox^?不会与细胞膜结合，因此无细胞毒性。

       注意：3小时后，需将此试剂洗脱，将细胞更换到新的培养耗材和培养液中，重新培养。

       此时，不应使用PCR方法检测细胞中支原体。由于支原体解体，故PCR结果为假性强阳性。

具体操作流程见下图：

Mynox^?祛除贴壁细胞中支原体的流程图

Mynox^?杀除支原体功能强大有效，但由于价格昂贵，上图中使用的200ul人民币要5000元左右，使得应用于细胞保种的数量受到价格的限制。

方法三：对于已耗费很多时间，大量扩增起来的细胞，或经过基因转染、体外刺激等大量工作处理过的细胞，如果发现细胞被支原体污染了，怎么办？此时由于前期工作量巨大，使操作人员无法丢弃已有细胞。

但由于价格原因，又无法使用方法二提到的昂贵试剂杀除细胞上的支原体，

同时，实验人员还需要清除细胞上的支原体污染，让实验得以往下推进，以最终获得准确的实验数据。

此时，实验者可选用对支原体特效的抑制剂，通过对细胞的前期处理，中期加药，逐步通过4代左右的培养，得以将支原体污染彻底清除，确保试验顺利推进，结果准确。

全世界此类试剂众多，笔者周围的实验人做过很多尝试，其中效果最确切且性价比较高的当属德国Minerva公司的ZellShield^?祛除剂。

它的原理是：通过抑制支原体增殖中某种蛋白的合成，达到抑制新的支原体增殖的目的。属复合型的新型抗生素。

注：使用ZellShield^?时，不需使用链青霉素。

操作步骤：

**步：研究发现，98%的支原体污染发生在细胞间隙。因此，首先要把细胞消化下来，放入离心管，悬浮冲洗，离心，弃上清，反复三次。此时可将细胞上大部分的支原体去除，为进一步加药抑制做好准备。

第二步：培养液中加入1%的ZellShield^?，细胞进行正常培养。新的支原体增殖受到抑制，旧的支原体随着细胞的换液逐步减少，通过4代左右的培养，细胞中的支原体基本可被彻底清除。

此试剂价格约2800元/50ml，1%浓度使用，可保证大量细胞的实验得以顺利推进。性价比较高，但祛除过程时间稍长。

有些细胞保种中心，当珍贵细胞被支原体污染后，会将Mynox^?和ZellShield^?结合使用，效果确切，结果令人满意。

工作环境中支原体污染，解决方案

如果实验室的细胞经常发生支原体污染，则需考虑的污染源可能来以下几个方面：

1、细胞种子被污染，解决方法参见以上“方法二”和“方法三”；

2、细胞培养中，使用未经严格过滤祛除支原体的牛血清。

某些血清生产厂，为低价占领市场同时还能获得充足利润，他们需要降低生产成本，所以会将生产中，成本最高的100nm过滤三次的步骤缩减，导致血清成为支原体的污染源。

(全球标准的血清生产规范为：粗血清需经七次过滤，最后三次为100nm加压过滤，可以清除支原体)；

此情况需详细考察血清供货商的专业程度，通过索要《检测报告》等书面文件为血清获得更多质量保证。同时，对专业水平不高的血清供货商，适当延长血清试用期。

3、洁净台、细胞培养箱内部、培养箱水槽、液氮罐，培养间内部的水浴锅等环境被支原体污染，可对工作区域进行消毒。有以下三种方法：

A、甲醛高锰酸钾熏蒸消毒

• 40%甲醛溶液用量为10ml/m³，高锰酸钾用量为5g/m³

• 先将称好的高锰酸钾放到开放性容器内，然后倒入甲醛溶液

• 人员迅速撤离，密闭消毒空间

• 熏蒸消毒要求密闭消毒24h以上

缺点：甲醛有刺激气味，细胞间1-2周无法使用。

B、酒精擦拭

• 用75%的酒精对超净台、培养箱、桌面等进行擦拭

• 再通风10分钟

• 紫外照射30分钟

缺点：操作较为繁琐，酒精容易挥发，消毒维持时间不长。

C、用专门清除支原体的喷雾剂或湿巾消毒

目前，被各大实验室普遍使用的是Mycoplasma-off^TM喷雾剂和湿纸巾。它添加了可主动杀除支原体的Mynox^?试剂，可在 几分钟内将支原体确切杀除，无残留，无腐蚀性，无致癌性。

• 均匀喷于待消毒的洁净台或实验设备表面

• 等待5-10分钟

• 用干燥纸巾将喷过的表面擦拭干净

• 通风2-3分钟

对于移液器，门把手，电话等器材，可使用支原体清除湿巾。擦拭后，应让其被消毒物体的表面保持湿润，再让其自然风干。

D、培养箱水槽、培养间内部的水浴锅

水槽经常会成为支原体以及真菌霉菌滋生的污染源。

解决方法：

• 勤于清洗显得尤为重要。

• 国际上普遍使用一种水源保护剂0.5%WaterShield^TM，加入水中，预防水源被支原体、真菌、霉菌污染。此试剂不易挥发。一个月有效。

水槽只需定期添水即可。

优点：操作方便，价格便宜。