MB公司支原体产品常见问题和解答

一支原体标准品部分

二支原体检测部分

三其他

一、支原体标准品部分

问：标准品有什么资格认证证明吗？

MB厂家具有ISO 9001和ISO 13485体系认证。每个批次支原体标准品都有验证和质控。同时支原体培养所用的培养基每个批次都依据EDQM（European Directorate for the Quality of Medicines）标准经过验证和质控。标准品每一批的质控证书（COA）可从厂家网站上下载。支原体菌株来自英国NCTC菌种保藏中心，也有相应的ATCC编号。

10CFU标准品主要经过下列三方面的质控：

1. 功能检测

即标准品复溶后作DNA抽提，再用专门合格的qPCR试剂盒检测，应保证有扩增曲线。

2. 活力检测

以保证标准品均已灭活。标准品在培养基中复溶并培养7天后，再进行DNA抽提和qPCR检测，Ct值和对照比，应不超过允许阈值（ΔCt >2）。

3. 检测阈限和批次合格标准

标准品用DMEM+5%FCS进行10倍梯度稀释，形成3个稀释度，DNA抽提后然后进行前后3轮qPCR检测，每轮每个稀释度重复8次。每种支原体的Ct平均值应达到如下标准，方为合格。

问：我们说的标准品就是质控菌的意思可以这么理解吗？

质控菌株相当于药典里的标准菌株。Minerva的所有标准品都是用于 qPCR或PCR验证的，如果客户是做别的用途，那就不适合了。

问：如何验证灭活菌和活菌是一样的？

因活支原体会造成实验室污染（这对用户来说是不可接受的），所以标准品采用的是灭活支原体。灭活支原体也是通过活支原体培养后再定量和灭活而来，它和活支原体的检测是一样的。最终检测结果说明一切。

问：溶解标准品后，抽提是否全抽完，还是也可以保存

厂家建议10CFU标准品复溶了以后，要立即抽提，不要再保存，因为担心可能降解。

问：您好，我这边要提取10cfu对照品的基因组，10cfu对照品的说明书写着用1ml基质重悬，基因提取试剂盒说一次上样200μl进行提取，想问您一下，用200μl基质重悬10cfu可以吗，想一次提完。

答：还是建议用1ml的基质重悬，因为灵敏度是以10CFU/ml为单位的。如果用200ul，浓度就高了。厂家建议10CFU标准品复溶了以后，要立即用完，不要再保存，担心可能降解。

问：那1ml溶解的标准品，按提取试剂盒的要求，就得用多个管子一次提完对吧？

答：是的。

问：支原体10cfu标准品是干粉吧？ 配完后是多少体积？

答：是冻干粉，加基质液后是1ML体积。

问：基质液产品里带吗？

答：这个产品里不带，是客户自己要检测哪类样品，就用样品里的基质液（例如用的哪个培养基）

问：标准品用1ml溶解，就是用培养基？

是用样本基质，要看客户样本是什么。如果是细胞上清，那就是用细胞培养基。要注意，溶解标准品的细胞培养基应没有支原体污染。标准品同时带阴性对照，阴性对照也是用培养基溶。

问：?支原体标准品一管可以用几次？

答：1管可以用4次，厂家原文是actually you will get 4x 200 ul out of one vial. The kit consists of 3 vials. Replicates of 8 tests are usually required for a validation. So 2 tubes are needed and 1 is for safety.

问：10CFU标准品，验证实验中用量，即验证实验时需多少有效数据？

答：10CFU标准品，使用时需要用1ml你的样本基质（如培养基）溶解，然后需要提取支原体DNA，以保证最高灵敏度（推荐MB公司的支原体DNA提取试剂盒）。每个DNA纯化柱需要样本量是200ul，产出是50ul。每个qPCR反应需要加DNA样本量是10ul。MB厂家推荐1个样本是8个复孔。一般灵敏度与耐用性（Robust）是在一起验证的，也就是说，要前后做3轮独立试验，每次每个样本建议是8个复孔，这样计算下来，2管10CFU标准品是够用了，这也正是10CFU标准品现在的包装。说明：为保证结果可靠性，还需要同时做阴性对照。

问：qPCR法，是否需要分别用不同种类DNA定量标准品分别做标曲，来检测同一个样本，那引物探针是否是根据不同种类支原体而不同。

答：qPCR法，如要定量，先需确定是测定哪种支原体，再用该支原体DNA标准品做标曲。引物探针都是用的MB公司的同一mix，它可识别多种支原体物种。

问：一管DNA定量标准品稀释后能用多久，如何保存。

答：一管DNA定量标准品稀释后在-18℃以下保存。避免反复冻融。保存时间和标签上的效期一样。

问：支原体标准品和支原体DNA标准品有什么区别吗？

答：德国MB公司提供的支原体10CFU标准品，用于PCR和qPCR检测方法的灵敏度验证。《欧洲药典》第2.6.7章规定，用 PCR或qPCR方法对支原体进行检测，其灵敏度需要达到10 CFU/ml。支原体基因组DNA是用于方法的特异性验证。还有一种标准品叫PCR定量标准品，也是基因组DNA，它用于梯度稀释，产生qPCR的标准曲线，具体请见网站相关页面。

问：支原体标准品有浓度参数吗？

答：MB的支原体标准品都是冻干粉，没有浓度。

问：如果客户购买10cfu标准品还需要提取基因组吗，直接用95度煮行吗？

答：按欧药方法，需要用试剂盒提基因组。

问：10CFU灵敏度标准品提取DNA后，DNA量能有多少？

答：厂家回复如下：if there is no additional DNA in the sample matrix (e.c. eukaryotic cells), the amount of DNA after extraction is below 0.0001 ng! The mycoplasma genome is only about 1000000 bp and one cfu corresponds with 1 to 10 genome copies.
Definitely, the DNA concentration is below the detection limit of photometric or fluorometric DNA quantification methods.

问：支原体10cfu标准品是干粉吧？ 配完后是多少体积？

答：是冻干粉，加基质液后是1ML体积。

问：基质液产品里带吗？

答：这个产品里不带，是客户自己要检测哪类样品，就用样品里的基质液（例如用的哪个培养基）

问：10cfu中阴性对照是什么？缓冲液？

答：阴性对照的制备，和支原体灵敏度标准品的制备一样，但它不包含任何支原体颗粒。制备时阴性对照必须用同样的样品基质来溶解。具体是什么没有提，应该这个是保密

问：特异性验证用基因组DNA怎么溶解？

答：基因组DNA使用说明如下：

1.以**速度离心5秒钟

2.将100 μl Tris缓冲液添加到DNA提取物中。

3.在室温下孵育5分钟。

4.短暂涡旋DNA并离心5秒钟。

问：灵敏度标准品GU：CFU比值（支原体基因组/菌落数比值）是多少？

答：每一种和每批次支原体标准品的GU：CFU比值都不固定，具体见批次的COA。下表可以参考。

二检测部分

问：提取试剂盒提DNA的回收率多少?

回收率依赖于DNA的类型（如GC含量，是基因组还是质粒）、操作者的技巧以及样本基质的情况。因为这些情况，操作者很难达到生产商所给的回收率，从而形成各种讨论，因此回收率没写到说明书里。但有一点可以很清楚，用该试剂盒从1ml只有10CFU支原体的样品中提取DNA，这个浓度已经很低了，但用PCR或qPCR方法仍然能够检测出来，这从侧面可以反映产率。厂家曾来信提到提取后的DNA的量在0.0001 ng以下! 支原体基因组约1000000 bp，1 cfu对应大约 1～10基因组拷贝。

问：提DNA是多少的体积洗脱，啥系统？

提DNA是用试剂盒中的缓冲液E   60μl洗脱。

整个提取方法，由四步组成：1）细胞裂解，2）DNA吸附到核酸纯化柱上，3）去除残留污染物和抑制剂，4）DNA洗脱。此方法无须酚/氯仿抽提，只需30分钟即可完成制备，提供PCR所需的DNA。

问：?qEP的内控和阳性有具体值吗？

这2个浓度厂家没有提，因为不需要提。可以明确的是：结果阳性还是阴性，是看Ct值（Ct=40可看作是分界点）。至于qPCR标准曲线，是不能用qEP盒子里的阳性DNA来制备的。需要单独购买PCR定量标准品，见http://www.cdhmbw.com/h-pd-210.html#_pp=0_516_328_-1

这里的标准品的量是明确的，每管是1×10的8次方copy

另厂家回复如下：We provide the concentration of the internal amplification control, but this DNA is artifical and not suitable for quantification. The positive control in the kit is not quantified precisely enough and due to the manufacturing process not accessibly in a quantitative form.

Therefore, we offer the PCR Quantification Standards.

问：Ct阈值为啥是40，39或41可以吗。是否有实验依据？

厂家已回信，原文如下：

the cut-off value is a result of the product validation, basically the evaluation of all runs performed for the sensitivity data

看上去是验证后的阈值，是不可改变的。

问：阳性高，内控就低的原理是什么？

支原体DNA和内控DNA二者同时进行扩增，存在竞争性抑制。因此当样本存在支原体污染时，由于内控对照与支原体DNA存在竞争，内控对照条带变弱（例如支原体DNA＞103拷贝）。相应的，在阳性对照中，内控对照条带会完全消失。

问：DNA提取kit磁珠和纯化柱区别大吗.？别人的提取试剂盒提支原体DNA有什么注意事项？

据我们了解，磁珠法是通过磁珠包被有互补配体进行纯化的。该方法的产率和核酸纯度均会受到一些因素的影响，如磁珠与核酸结合的效率，以及样本中的抑制剂。厂家回信说，DNA提取试剂盒的性能依赖于样本基质的组成。某些样品用磁珠法提取效果较好，一些其他样品用离心柱的效果较好，没有普遍的规律。关于别人的提取试剂盒提支原体dna有什么注意事项，我们对其他家的试剂盒不太了解，我们只负责MB的试剂盒。MB的支原体DNA抽提试剂盒对于支原体的DNA抽提，属于离心柱法，经过广泛测试，包括不同的样本基质类型。发现即使10CFU的支原体，也可以提取DNA并被检测到。

问：qEP和qonestep什么区别，能否替代

二者有2个区别，一是qEP的内控对照是独立包装，而 qOneStep的内控对照是在预混液内；二是qEP经过厂家方法验证，厂家有验证报告。qOneStep没经过厂家方法验证，没有验证报告。所以对于qEP可用于放行检测，qOneStep只推荐用于支原体筛查，不能用于放行检测。同时因为qOneStep加入的样本量是2ul，而不是qEP的10ul, 这回给检测阈值带来5倍的影响。qOneStep灵敏度在说明书上没有提，一个批次的COA上提到是50个基因组拷贝/反应。

需要说明的是，厂家的验证只保证试剂盒符合药典要求。但不能替代操作过程及样本的适用性检查。

问：厂家是做过与培养法做平行对照及验证？

厂家做过qEP的方法验证，同时也做了培养法的平行对照，它也是验证报告的一部分。

问：在用qEP做支原体检测的时候，加入内控对照品，在仪器设置上是需要选择两个通道吗？

答：是需要2个通道，一个FAM,
一个HEX，HEX是对应内控的通道。

问：我想问一下，7500仪器里面没有HEX这个通道选项，可以用哪个通道代替呢？

答：7500这款是没有HEX荧光标识，不过问过厂家，说7500有VIC，可以用VIC通道。

问：qPCR结果判定中，FAM positive，HEX irrelevant中这个不相关是具体指什么？

答：这个不相关是指如果FAM是阳性，那么由于扩增时存在竞争性抑制，所以内控是否有扩增，其无关紧要。二者存在竞争性，是因为酶和dNTP对于二者的扩增都是需要的，这将决定新合成的DNA的量各自有多少。

问：在用样品制备试剂盒时，进行支原体DNA提取时，加入内控对照品，实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA，而无法监测这步操作的回收率的，是吗？

答：“实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA”，可以这么理解，或者说是在监测整个提取过程。我们又问了一下厂家，内控和样品的提取效率是一样的，这样可以反映样品的真实情况，因为只要内控提取后能测出来，那就表明提取是没有问题的。极少量的支原体如10CFU的，通过提取，也是可以检测到的，表明灵敏度是没有问题的。样本Ct值和10CFU的Ct值比较，是可以进行相对定量的。

问：你们好，我问一下你们这个Venor Gem qEP试剂盒能做放行检测吗?

答：放行应相当于国外说的release testing,
这个qEP试剂盒是符合国外药典规定的性能，能做放行检测的。同时需注意要做支原体DNA抽提才行，抽提是用另外一个盒子，见厂家的venor gem sample preparation kit。

问：这个如果是用来检测细胞上清，是不是就不用提取DNA了呢？

答：只要是跟药典有关，跟临床治疗或制药检验有关，就需要提取DNA。如果仅仅是科研用培养细胞，筛查支原体，则可以不提。

问：询问qPCR仪器的设置

答：具体可见MB厂家文件Venor?GeM qEP: Cyclers Programming，可从网站上下载。

问：被动参比染料是选“none”吧？

答：对，没有ROX，选none

问：大家好，想咨询一下，咱们支原体DNA提取时所取的样本量是依据什么定的呢，比如，我们有CAR-T细胞，病毒液等，如果CAR-T细胞按细胞数来的话取多少细胞数比较好，或者如果病毒液按体积的话多少体积更佳呢？

答：支原体
DNA
提取试剂盒可从最多含有
1X 106细胞/ml
的细胞上清中直接分离
DNA，病毒没有要求。总体积最多
200μl。提取的样本就是细胞上清，ATMPs（高级医用药品），细胞培养基等。病毒液应该也是最初来自细胞上清吧。样本量是根据支原体污染量得出的经验值，跟核酸纯化柱上的DNA膜吸附能力有关。

问：病毒液就是类似细胞上清的。如果体积大于200ul的话我们可以浓缩，但是这个体积有没有一个上限呢？

答：体积有上限，是200 to 1000 μl,
可以参看经典法试剂盒的那个说明书里对样本处理那一块。这个样本量同时还考虑了灵敏度，使检测达到**的灵敏度。如果细胞数高于1X 106细胞/ml
，那必须要先调细胞数了。或者减少样本体积，总细胞数不超，也行。

问：这个抽提试剂盒的收率有多少，是磁珠还是吸附柱？吸附柱的收率**能有，因为以前我们用其他品牌的抽提试剂盒，收率只有百分之六，这样的话，就存在假阴性结果的可能。

答：是吸附柱的方法。提取试剂盒的COA里，用的是很少量的支原体10CFU/ml，提取DNA后都可以检测到。厂家来信说，产率依赖于DNA的类型（如GC含量，是基因组还是质粒）、操作者的技巧以及样本基质的情况。因为这些情况，操作者很难达到生产商所给的比率，从而形成各种讨论，因此产率没写到说明书里。

问：要检测支原体的培养基中有酚红，是否还需要抽提？

答：只要是在25ulPCR体系中加入的样本量≤2ul，酚红就不会对qPCR构成问题。更高浓度的酚红会引起基线偏移，造成灵敏度降低。如果仅仅是筛查，则不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的产品放行检查，则需要抽提了。细胞基质的验证总是要做的。

问：做qPCR，一个阴性对照Ct约为40，也有扩增曲线。是什么原因？

答：Ct值大于40可能是由于产生非特异性信号（如primer artefacts）以及极微小的污染所致。 但是，该结果是不具有可重复性的，因此结果仍然是阴性。

问：一步法的盒子的灵敏度是否总低于经典法试剂盒？有没有可能一步法的盒子也能检测10CFU？

答：厂家回复如下：意思是一步法的样本量为2ul用于支原体筛查，经典法为10ul，用于产品的放行检测。检测10CFU的标准品非常具有挑战性。一步法因为样本量不够，很难达到10CFU/ml。如果客户想要包含DNA聚合酶的PCR试剂盒，可以选择VenorGeM Classic G型试剂盒。它和经典法（不含酶）的交叉验证确实做过，显示同样的灵敏度。但全套的验证没有做过。

问：PCR经典法，跑胶时体现1条阳性带，是否代表PCR经典法可以检测多种支原体，无法区分支原体种类？

答：PCR经典法，跑胶时为1条阳性带，无法区分支原体种类，需要将扩增产物测序鉴定。

问：qEP的阳性对照一个25次的盒子里大概可以做几次？

答：这个阳性对照是绿盖管，复溶是加300ul水。如果是科研，每次用2ul。制药是每次用10ul，这样分别是做150次和30次。但是大包装的qEP的阳性对照仍然只是1管或2管。

问：如何设置阈值线？
据我所知，基线通常是循环3到循环15的值。阈值线是基线标准差的10倍。这正确吗？

答：设置阈值的一种好方法是将其置于阳性对照扩增曲线的线性区域的中间（如果以对数坐标显示）。

问：内控对照的曲线和样品扩增曲线是否共享同一阈值线？

回答：是的。

问：是否每次做支原体DNA抽提时都要设阴性对照？

答：不需要。只有灵敏度标准品抽提时才需要设阴性对照，以避免外源干扰。

问：一药厂关于细胞发酵液，检支原体的问题

1000升反应器，有血清培养，抗体药，想用qpcr检支原体，更利于大规模样品的自动检测。原有用过罗氏和AVI的qPCR检测盒子，都发生过抑制pcr现象,所以，想找厂家了解：

①Minerva的qPCR盒子，是否经常碰到抑制的现象，怎样规避？

②是否可以找厂家要小规模样品试试

③关于药厂类的客户，方法学验证上有什么资料吗？希望能看看检测报告？检测敏感度希望做到<10CFU。

答：①细胞培养基随着时间的延长，可能积聚抑制 PCR 的物质。已知血清含量大于 12%的培养基对下游操作（例如 PCR）有抑制作用。而且，培养基中的酚红，对 qPCR 的荧光检测也有交叉作用，产生假阳性。这些弊端可通过支原体 DNA 提取试剂盒(Minerva厂家有提供)提取样本DNA来克服。

②目前有qPCR一步法的样品试剂盒。如客户需要qPCR检测方法符合欧洲药典，可则选用qEP试剂盒（也是qPCR方法），该样品厂家应可以提供。如不需要符合欧洲药典，qPCR一步法的样品试剂盒就可以。但在使用之前，务必要做样品中的DNA提取，以规避样品中抑制PCR反应的物质。

③关于药厂类的客户，方法学上有验证。qEP试剂盒有验证资料，可以提供，但为内部参考，请不要外传。qEP灵敏度可以达到10CFU及以下。Minerva厂家也提供有10CFU支原体标准品（包括套装或单种支原体）可以验证检测的灵敏度。

支原体 DNA 提取试剂盒目前我们无样品，可能厂家有样品，待联系。

其提取方法容易操作，分为四步：1）细胞裂解，2）DNA 吸附到核酸纯化柱上，3）去除残留污染物和抑制剂，4）DNA 洗脱。此方法无须酚/氯仿抽提，只需 30 分钟即可完成制备。

以下附上产品中文说明书以及qEP验证报告。

问：一步法的盒子的灵敏度是否总低于经典法试剂盒？有没有可能一步法的盒子也能检测10CFU？

答：一步法的样本量为2ul，经典法为10ul（工业样本）。检测10CFU的标准品非常具有挑战性。一步法因为样本量不够，很难达到10CFU/ml。如果客户想要包含DNA聚合酶的PCR试剂盒，可以选择VenorGeM Classic G型试剂盒。

一步法和经典法的交叉验证确实做过，显示同样的灵敏度。但其他验证没测过。

原文如下：

The product VenorGeM OneStep works with 2 ul sample volume and is designed for screening. VenorGeM Classic works with 10 ul sample volume max. and was designed for sensitive product release testing. As the detection limit of 10 CFU/ml is is extremly challenging, VenorGeM OneStep will not be able to provide such sensitivity due to the lack of sample volume.

If the customer wants to get the benefit of included polymerase, the VenorGeM Classic G-Version might be an option. Anyhow, we do only have a cross-validation in place and not a full-product validation, showing equal sensitivities for one mycoplasma species.

问:一种支原体的存在会干扰另一种支原体的DNA定量吗？
答: 当然。它们会都显示作为支原体，除非你有专门针对这两种支原体中其中一种的qPCR

三 其他

问：关于zellshield 客户是自己配干粉培养基，过滤孔径0.22um。过滤前加还是过滤后加，会不会把zellshield有效成分滤掉？转染质粒和包病毒会不会有影响？双抗对有的转染试剂有些影响我们的zellshield呢？

Zellshield可以先加到培养基中，再过滤。Zellshield不影响质粒转染或病毒包被。但请注意，支原体在Zellshield作用下会抑制生长。支原体会干扰质粒转染或病毒包被。

问：Mynox与Mynox Gold区别？

答：Mynox Gold是套装，包括1管**治疗液和3管巩固防护液。**治疗液主要为Mynox，但它的浓度要比单纯的Mynox产品浓度要低，它对细胞毒性可忽略不计，巩固防护液主要为复合抗生素成分。Mynox Gold对细胞更温和，更适合原代细胞或娇贵的细胞，但需要细胞传四代才能完成所有治疗，需要时间较长。但它不适用于病毒液中的支原体清除。

Mynox产品是只作用1次，用1管，它适用于病毒液中的支原体清除。也适用细胞系等较好养细胞中的支原体清除。它对细胞有一定毒性，使用时需要经常观察。细胞可能存在一定损失，这会通过细胞的增殖予以弥补。如果Mynox的细胞毒效应比较明显，应立即换液以终止治疗。如果细胞对Mynox比较敏感，治疗时间可缩短，贴壁细胞可缩短至半小时，悬浮细胞缩短至15分钟。

要注意，Mynox是通过与支原体接触才发挥作用的，使用时要将细胞打散，不能成团，否则支原体藏在细胞团的间隙中，影响Mynox与支原体的结合。同时要注意FCS的浓度不能高于5%。对于病毒悬液，需先离心1000rpm，5分钟去除细胞碎片，再进行Mynox对支原体的清除，否则细胞碎片会产生竞争性结合。