科研中，如何快速检测SARS-CoV-2？

　　一、产品用途：

　　新冠病毒RT-qPCR引物/探针(套装)(英文名：SARS-CoV-2 Confirm)，用于定性检测和分析新冠病毒RNA。它仅用于研究，不用于临床诊断。

　　品名货号/规格存储

　　新冠病毒RT-qPCR引物/探针(套装)

　　英文名：SARS-CoV-2 Confirm

　　品牌：德国MB公司(Minerva Biolabs)271-2100

　　100个反应/盒2-8℃避光。

　　冻干粉复溶后在-18℃以下保存

　　二、产品描述：

　　1. 该产品包括三个小管：

　　①橙盖： 2019-nCoV Mix(冻干粉)，1管。

　　此管为新冠病毒引物/探针，可特异性扩增新冠病毒的RdRp基因(即RNA依赖性RNA聚合酶基因)，而其他冠状病毒RNA不会被检测到【1】【2】。(该引物/探针依据WHO诊断参考实验室公布的新冠病毒引物/探针序 列而设计【1】。更多详情可访问：

　　https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance)。

　　如要检测其他冠状病毒，推荐MB公司提供的其他冠状病毒引物/探针，品名：CoV Screen (without ConviFlex?RT-Taq Mix)，货号：271-1100。

　　②绿盖：Positive Control RNA(阳性对照RNA，冻干粉)，1管。

　　此阳性对照RNA为一段合成的RNA序列(序列来自武汉的病毒株)。

　　③白盖：PCR Grade Water(液体)，1管。

　　2.使用前，①橙盖和②绿盖先用PCR级水(③白盖)复溶，并分装，避免反复冻融。

　　3.该引物/探针应与MB公司提供的【RNA病毒检测试剂盒】(英文名：ConviFlex?RT-Taq Mix,货号192-0025/-0100/-0250)一起使用，用于新冠病毒RT-qPCR反应检测。

　　4.检测样本需为抽提过的RNA样本。

　　5.新冠病毒的靶基因RdRp是用FAM?通道检测，扩增的人RNA酶P基因(过程对照)用ROX?通道检测，用以评估样本的制备质量。

　　三、产品特点：

　　1. 靶点特别。依据WHO国际标准，此引物探针为新冠病毒RdRp基因，而非市面上常见的ORF1ab和N基因或E基因。

　　2.阳性对照RNA为一段合成的RNA序列。

　　3. 主要组分为冻干粉，4℃保存，储存运输方便，性能稳定。

　　4. 适用于科研中，各种来源的RNA样本，包括拭子、活检组织、哺乳动物细胞和细菌等。

　　四、需用户自己准备的试剂耗材和仪器：

　　1. RNA病毒检测试剂盒(RT-qPCR法)(英文名：ConviFlex? RT-Taq Mix，货号192-0025/-0100/-0250)

　　2. 荧光定量PCR仪(qPCR仪)

　　3. 无DNase和RNase的qPCR反应管

　　4. 离心机

　　5. 移液器及带滤芯吸头(不含DNase和RNase)

　　6. 用户自己提取的RNA或现成的RNA样品。(抽提过程建议使用商品化的RNA提取试剂盒完成，如MB厂家的：【病毒RNA提取试剂盒】(ExtractNow? Virus RNA Kit，货号611-1010/-1050/-1250)或【病毒RNA拭子提取试剂盒】(ExtractNow? Virus RNA Swab Kit，货号611-2250)。

　　五、操作注意事项：

　　1. 该引物/探针应仅由经过培训的实验室人员使用。

　　2. 始终穿上合适的防护服和戴一次性手套。

　　3. 根据样品类型，应谨慎处理所有样品。

　　4. 请遵循WHO推荐的方法处理样本。

　　5. 该试剂盒不含有害物质。残余物可以根据当地法规丢弃。

　　六、操作步骤：

　　步骤1. 试剂制备：包括试剂溶解等预处理步骤

　　步骤2. RT-qPCR引物/探针mix制备

　　步骤3. 设置qPCR程序

　　步骤4. 启动程序

　　步骤5. 数据解读

　　FAM? 通道ROX? 通道 说明

　　阳性阳性检测到SARS-CoV-2 RNA

　　阳性阴性检测到SARS-CoV-2 RNA

　　阴性阳性未检测到SARS-CoV-2 RNA

　　阴性阴性结果无效

　　七、使用注意事项：

　　1. 使用前应认真阅读说明书。

　　2. 来自不同批次的试剂不能混合。

　　3. 试剂盒内的试剂应始终作为一个整体溶解分装。

　　4. 试剂盒应在效期内使用。

　　5. 每次PCR至少应设置一个阳性对照。每次PCR至少应设置一个阴性对照和/或一个无模板对照。

　　6. 建议在无RNA和DNA污染的条件下进行RT-PCR，以避免操作过程中DNA或非特异RNA的交叉污染。(MB公司推荐使用PCR污染祛除喷雾，英文名：PCR Clean?，货号15-2025，预先清洁实验环境。)

　　7. 尽量减少RNA样品的冻融次数，同时避免RNA酶污染，以减少RNA降解的风险。(RNA降解会极大地限制了RT-qPCR反应的性能)。请确保高质量的完整RNA用于检测。

　　8. 样本制备过程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干扰也会降低qPCR的准确性。

　　八、参考文献

　　1. Corman VM, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Drosten C. Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2

　　2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.

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