分享细胞复苏、传代、冻存流程

细胞培养大致可以分为三个步骤，细胞复苏、细胞传代、细胞冻存。今天小编就跟大家分享一下细胞复苏、传代、冻存的操作流程。

细胞复苏

液氮中取出的细胞，待液氮挥发后，马上将细胞冻存管置于37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（尽量控制在2min内，时间过长了可能会影响细胞的状态）。在解冻时，冻存管瓶口尽量控制在水面以上。

解冻后，将冻存管转移到无菌操作台，75%酒精擦拭冻存管外部。

将细胞悬液转移至，装有37℃预热的培养基离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，弃上清。

重新加入经预热培养基重悬细胞，以适宜密度，一般约为(3~5)×10^5个/ml密度接种到培养器皿（直径10cm）中。放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。

细胞传代

用移液器吸取并丢弃使用过的细胞培养基（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染），并用PBS缓慢冲洗细胞2次。

以直径10cm的培养皿为例，向培养皿中加入500μl胰蛋白酶-EDTA（根据各细胞的使用说明，选择合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育（一般2分钟左右即可）。镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流即可终止，此时应加入2-3ml含血清的完全培养液终止消化（细胞的解离时间标准可能偏差，根据细胞来源确定，有些细胞属于半贴壁，无需胰蛋白酶也可解离）。

吸取所有培养皿内的液体，沿培养皿底部缓慢吹打，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应尽量避免气泡的产生）。

把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后弃上清。

加入培养基重悬成单细胞悬液。按实验所需的细胞量添加到新的培养皿中，将培养皿37 ℃ 孵育，每天观察细胞的贴壁情况。

注意：向培养皿加液体时，建议从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。若是悬浮细胞传代培养，过程中省消化步骤。

细胞冻存

按照“细胞传代”中的步骤收集细胞。

加入细胞冻存液（一般10%DMSO+对应细胞的培养基），重悬细胞，使细胞的终密度为(5~10)程序降温，更推荐使用程序降温盒。若手动进行降温，冻存的一般程序为降温速度1～2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可将降温速度增加至5℃～10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

以上就是细胞复苏、传代、冻存的操作流程了，细胞培养应选择优质的胎牛血清，缔一生物提供ausbian进口特级胎牛血清，内毒素低，多个批次供应选择。

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