细胞培养时如何进行支原体污染的检测

在细胞培养过程中，支原体污染的检测至关重要，以确保实验结果的准确性和可靠性。以下是支原体污染检测的主要方法和步骤：

1.相差显微镜检测

原理：支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。

步骤：

将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上。

24小时后取出，用相差油镜观察。

2.荧光染色法

原理：利用荧光染料使支原体DNA着色，通过荧光显微镜观察。

荧光染剂Hoechst 33258检测支原体污染的原理：染色剂会结合到DNA A-T富含区域，支原体A-T含量较高（55％~80％），因此可将其染色而检测。

步骤：

制备标本：在六孔板中制备盖玻片细胞培养物，接种待测细胞，培养1～2天。

固定：用新鲜配制的1：3冰醋酸/甲醇固定液固定15分钟，重复固定一次，然后干燥。

染色：用Hoechst 33258荧光染液染色30分钟，避光操作。

洗涤：用双蒸水浸泡染色过的盖玻片3次，每次3～5分钟。

封片：滴加含50％甘油的柠檬酸缓冲液到染色过的细胞表面，然后封片。

观察：在荧光显微镜下观察细胞的荧光分布状态，判断有无支原体污染及污染程度。

3.PCR法检测支原体

原理：基于酶促DNA合成反应，扩增支原体DNA，检测其存在。

步骤：

提取标本DNA（如酚氯仿法）。

使用特定引物和DNA聚合酶进行PCR扩增。

通过凝胶电泳或其他方法检测PCR产物，确认支原体污染。

4.扫描电子显微镜法

原理：利用扫描电子显微镜直接观察支原体。

特点：直观、准确，但操作复杂，实验周期长，常作为最后定性检测。

5.DNA分子杂交检测或支原体培养等方法

这些方法也可以用于检测支原体污染，但具体步骤和原理因方法而异。

注意事项

在进行支原体污染检测时，应使用无菌技术和适当的防护措施，以避免交叉污染。

选择合适的检测方法和步骤，根据实验需求和条件进行选择。

对于疑似支原体污染的细胞培养物，应及时采取措施进行处理，以避免对实验结果产生不良影响。