GyrI-like 蛋白通过其环丙基水解活性实现细胞保护功能

微生物对抗生素的抗性是一种古老的自然现象，它的出现远远早于人类对抗生素的使用。临床上使用的抗生素有相当一部分是由微生物发酵产生的，这些微生物需要进化出对应的抗性基因来保护自己免受所产生抗生素的伤害（自抗性）。这些抗性基因在不同微生物间的水平转移导致多药耐药菌、甚至泛耐药菌变得越来越普遍。因此，对抗生素的生物合成与自抗性机制的研究将有助于人们对抗性基因的产生、进化以及转移得到深入的认识和理解。

中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室的唐功利课题组多年来一直致力于对结构独特、活性显著的复杂天然产物进行生物合成和自抗性机制研究，从酶催化反应的角度理解自然界神奇的化学反应和生理性拮抗的生化 / 化学本质，属于典型的有机化学 - 微生物学 - 生物化学 - 天然产物药学的交叉学科，对于天然产物药物研究中重点关注新结构的发现、创造和复杂化合物的高效制备均具有重要的推动作用。

以谷田霉素（YTM）和 CC-1065 为代表的苯并二吡咯生物碱家族抗肿瘤抗生素的生物合成和自抗性机制研究则集中体现了上述思想。该家族的天然产物是一类来源于微生物、含有环丙烷药效团的高活性天然产物，目前包括 YTM、CC-1065 和多卡霉素。这些化合物主要是对细胞内的遗传物质 DNA 进行烷基化修饰，从而达到杀死细胞的目的（IC50 为 pM 级）。研究表明这类化合物是靶向治疗中理想的“弹头”，例如，由多卡霉素衍生的抗体药物偶联分子 MDX-1203 已进入临床一期，主要治疗非霍奇金淋巴瘤和肾细胞癌。唐功利课题组前期克隆了 YTM（J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 8831）和 CC-1065（ACS Chem. Biol., 2017, 12, 1603）的生物合成基因簇，并发现 DNA 糖苷酶 YtkR2 可以将由 YTM 烷基化引起的损伤碱基移除，从而开启 DNA 的一系列修复机制（Angew. Chem. Int. Ed.,2012, 51, 10532）。

最近，唐功利研究团队在该家族天然产物的自抗性机制研究方面再获新突破。该团队从 YTM 研究材料出发，证明了 YtkR7（属于 GyrI-like 家族蛋白）可以水解 YTM 的环丙基，从而起到 YTM 失活的目的。接下来他们揭示了 GyrI-like 家族的一个亚家族蛋白（截至 2016 年 9 月已有 1696 条蛋白序列都来源于原核生物）具有水解 YTM 和 CC-1065 环丙基的特性，这也是 GyrI-like 家族蛋白成员**证明具有酶的活性（作者将这类酶定义为 cyclopropanoid cyclopropyl hydrolase, CCH）。

图 1. CCH 蛋白催化环丙烷化合物的环丙基水解反应

为了深入阐明 CCH 是如何识别并催化底物中环丙基水解反应的机理，唐功利课题组与上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室的周佳海课题组以及瑞士洛桑联邦理工学院 EPFL 的袁曙光课题组在晶体学和计算生物学方面展开合作，通过共晶结构以及分子动力学模拟发现，CCH 蛋白都具有一个保守的用于多种底物结合的芳香口袋（由 Y46、W85、W99、F154 和 Y187 组成）以及两个高度保守的负责催化的酸性氨基酸残基对（E185/E157）。作者通过点突变实验证实了这个芳香口袋和催化残基在 YTM 和 CC-1065 环丙基水解反应中起着关键作用，随后提出了可能的催化机理。

图 2. 通过共晶复合物以及分子动力学模拟研究 CCH 蛋白成员 lin2189 与底物 YTM 的识别

接下来，作者从 CCH 蛋白中选取四个代表成员 YtkR7、lin2189（来源于 Listeria innocua）、ETI84332.1（来源于 Streptococcus anginosus，属于肠道微生物）以及 MA1133（来源于 Methanosarcina acetivorans），并将其分别转化大肠杆菌，发现这些蛋白都能够赋予大肠杆菌对 YTM 的抗性。

GyrI-like 蛋白广泛存在于原核与真核生物中（截至 2016 年 9 月已有 12304 条蛋白序列），这类蛋白被注释为小分子结合蛋白。但是这种小分子结合属性**于对枯草芽孢杆菌 MerR 家族调控蛋白 BmrR 的研究。BmrR 可以对多种结构不同的配体化合物进行响应，而结合了配体的 BmrR 能够激活多药抗性外排泵蛋白 Bmr 基因的转录，从而起到细胞的自我保护作用。SbmC 和 Rob 是 GyrI-like 家族蛋白中另外两个已报道的具有生理功能的成员。但是，SbmC 和 Rob 是否能结合小分子尚无文献报道。因此，在文章最后，作者通过分子互作分析（SPR）证明了 SbmC、Rob 以及 YtkR7 均保留了结合若干抗生素的能力。

CCH 蛋白功能的发现使人们重新审视 GyrI-like 蛋白功能，即生物体利用 GyrI-like 蛋白作为抗生素抗性蛋白可能是一种古老的现象，这类蛋白可以看作是细胞内的清道夫，通过隔离外源性有毒化合物达到保护细胞的目的。因此，这项工作不仅为真核生物中 GyrI-like 蛋白的功能研究提供了重要的借鉴，也为药物研发领域提供了一定的参考意义。

这一成果发表在最近的 Nature Communications 上，唐功利课题组的袁华副研究员和周佳海课题组的张金儒博士为共同**作者。该工作得到国家自然科学基金委、上海市科委和中国科学院战略性先导科技专项（B 类）等经费的大力资助。