化學(xué)限定細(xì)胞培養(yǎng)基的優(yōu)化

化學(xué)限定細(xì)胞培養(yǎng)基的優(yōu)化

——細(xì)胞體外培養(yǎng)方法中取代胎牛血清

作者：J. van der Valk, D. Brunner , K. De Smet, ?. Fex Svenningsen, P. Honegger, L. Knudsen, T. Lindl, J. Noraberg, A. Price, M.L. Scarino, G. Gstraunthaler

刊登于Toxicology in Vitro. 2010，24(4): 1053-1063

1. 背景

要使細(xì)胞存活更長時(shí)間或評(píng)估它的增殖、遷移和分化，一個(gè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基肯定是不夠的，需要添加一些因子。血清是最常用的細(xì)胞維持和增殖的添加成分，特別是胎牛血清。然而，胎牛血清的使用也存爭議。一、使胎牛遭受痛苦。二、血清成分的批次波動(dòng)。三、潛在的污染，如BSE，這使得動(dòng)物源材料在新型生物藥的生產(chǎn)中被強(qiáng)烈排斥。事實(shí)上，在20%-50%的商品化FBS中存在病毒陽性。

以無血清培養(yǎng)基應(yīng)用為主要內(nèi)容的良好細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐（Guidelines for Good Cell Culture Practice, GCCP）已發(fā)表。ECVAM科學(xué)建議委員會(huì)（ESAC）也發(fā)表了一個(gè)聲明，強(qiáng)烈建議使用無血清替代物。盡管實(shí)施GCCP還沒有形成法規(guī)，但GCCP已成為GLP和GMP的一部分。

一個(gè)工作坊于2003年開始啟用，討論減少細(xì)胞和組織培養(yǎng)中FBS使用的可能性。本次會(huì)議的報(bào)告明確建議，減少或停止未出生的用于生產(chǎn)FBS的牛犢的痛苦。倫理、安全性和科學(xué)根據(jù)也在會(huì)上給出，用于替代細(xì)胞和組織培養(yǎng)方法中的FBS。2009年又開了一次工作坊，討論了無血清培養(yǎng)基的現(xiàn)狀。工作坊在丹麥哥本哈根舉行，是在歐洲體外毒理學(xué)會(huì)（ESTIV）、荷蘭-比利時(shí)體外方法學(xué)會(huì)（INVITROM）和丹麥體外毒理學(xué)網(wǎng)絡(luò)贊助下組織的。本次工作坊的結(jié)果清楚地顯示了是可以開發(fā)出一些不同原代細(xì)胞和組織以及細(xì)胞系的無動(dòng)物成分培養(yǎng)基的。而且，該會(huì)還給出了指導(dǎo)意見，用于開發(fā)無血清、化學(xué)限定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)基。

2. 無血清培養(yǎng)基的開發(fā)

無血清培養(yǎng)基的開發(fā)可追溯到1955年。早期嘗試是用無血清、激素補(bǔ)充的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，以了解血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的作用，并努力識(shí)別血清中所有與細(xì)胞增殖有關(guān)的生理成分，并用那些成分進(jìn)行替代。該努力沒有成功。從那時(shí)起，幾種不同無血清制劑的配方已經(jīng)出來了，培養(yǎng)基補(bǔ)充了大約十個(gè)必要成分。其成功率為10-20％。1976年，G.佐藤進(jìn)行了開創(chuàng)性的工作，開發(fā)出一個(gè)好的化學(xué)限定無血清培養(yǎng)基。他通過添加特定激素來替代血清，能促進(jìn)細(xì)胞生長和分化。在最近10年里，對(duì)細(xì)胞功能的研究更為深入，已能鑒定出更多成分，加入到無血清培養(yǎng)基中使其性能更佳。許多轉(zhuǎn)化細(xì)胞或新轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以成功地在這些無血清培養(yǎng)基中維持生長而無需適應(yīng)。并且細(xì)胞特異的培養(yǎng)基數(shù)量還在穩(wěn)步增長。現(xiàn)在，有超過一百種不同的無血清培養(yǎng)基配方已經(jīng)開發(fā)出來，并且可以購買使用，而無須自己開發(fā)。

2.1. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

隨著時(shí)間的推移，很明顯幾乎每種類型細(xì)胞都有自己的營養(yǎng)需求，因此，廣譜的細(xì)胞無血清培養(yǎng)基幾乎不可能。不同類型細(xì)胞具有不同受體，參與細(xì)胞的生存、生長和分化，并釋放不同的因子到環(huán)境中去。由于開發(fā)新型的無血清培養(yǎng)基門檻較高，下面討論一些研發(fā)策略。

建議開始新配方時(shí)，使用DMEM和Ham's F12的50:50（v / v）混合物。該配方結(jié)合了DMEM的高氨基酸含量和Ham's F-12的高營養(yǎng)。此外，基礎(chǔ)培養(yǎng)基必須含有一種基礎(chǔ)成分，即ITS添加劑（胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒）。胰島素，從1924年起，已是細(xì)胞培養(yǎng)中必不可少的，現(xiàn)在是培養(yǎng)基中最常用的激素。轉(zhuǎn)鐵蛋白也是一種培養(yǎng)基中的必需蛋白質(zhì)，其主要作用是將鐵轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。硒是一種必需的微量元素，尤其在硒蛋白中起作用，它可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。

2.2. 添加劑

盡管有些細(xì)胞類型可以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中維持生長，但大多數(shù)細(xì)胞需要添加劑以存活、增殖或分化。大多數(shù)常見的添加成分如下：

2.2.1 激素

所有哺乳動(dòng)物的激素都是血液循環(huán)中的生理成分。因此，它們也以不同的量存在于血清中。 因此，補(bǔ)充激素是開發(fā)無血清培養(yǎng)基的**步。胰島素在所有無血清培養(yǎng)基配方中都是必需的。 其他常用激素有糖皮質(zhì)激素（地塞米松、氫化可的松）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）和能升高細(xì)胞內(nèi)cAMP的細(xì)胞特異性激素。水溶性甾體激素也可用。

2.2.2 生長因子

通常將生長因子添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以增加細(xì)胞增殖和刺激特定細(xì)胞功能。 傳統(tǒng)上，生長因子和其他補(bǔ)充劑是以胎牛血清（FBS）的形式添加。大多數(shù)生長因子是高度細(xì)胞特異性的，其他的則更廣譜，可以對(duì)幾種不同的細(xì)胞類型也有陽性效應(yīng)。FGF-2，例如，對(duì)無血清培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表型有陽性作用。培養(yǎng)的細(xì)胞有些可以釋放生長因子，刺激自身和其他細(xì)胞的增殖。

2.2.3 蛋白酶抑制劑

添加的FBS包含蛋白酶抑制劑，即α1-抗胰蛋白酶和α2-巨球蛋白。蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化，并且通過抑制細(xì)胞更新時(shí)偶爾釋放的溶酶體肽酶而對(duì)細(xì)胞有益，蛋白酶抑制劑對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，但不是必需的。當(dāng)沒有提供蛋白酶抑制劑時(shí)，應(yīng)該仔細(xì)評(píng)估胰蛋白酶的濃度。

2.2.4蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物

蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物用于提供氨基酸和短肽。這些不是細(xì)胞培養(yǎng)中必不可少的成分，其效果有爭議。事實(shí)上，一些研究報(bào)告蛋白水解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的有益作用，其他一些研究證明蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物不支持細(xì)胞生長，而且更高的濃度會(huì)減少細(xì)胞生長。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物不是化學(xué)限定的成分，在可重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)的可比性上可能存在問題。

2.2.5剪切力保護(hù)劑

生物反應(yīng)器和灌注培養(yǎng)液中的湍流導(dǎo)致細(xì)胞的剪切應(yīng)力。 血清能保護(hù)細(xì)胞免受

這種剪切力損傷。 Pluronic F68具有類似的效果，但對(duì)于普通細(xì)胞培養(yǎng)不是必需的。

2.2.6 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是不同低分子量組分的載體，并且可以促進(jìn)細(xì)胞黏附。 牛血清白蛋白通常用作脂質(zhì)載體。然而，BSA來自動(dòng)物，可能受到污染或包含雜質(zhì)。 如今，可獲得重組蛋白，包括白蛋白用于無動(dòng)物成分的細(xì)胞培養(yǎng)。

2.2.7 維生素

維生素由基礎(chǔ)培養(yǎng)基提供。至少有7種維生素對(duì)細(xì)胞生長和增殖至關(guān)重要：膽堿，葉酸，煙酰胺，泛酸，吡哆醛，核黃素和硫胺素。B族維生素是細(xì)胞生物化學(xué)所必需的，并且也存在于DMEM以及Ham F-12中。

2.2.8.氨基酸

培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，至少13種氨基酸是必需的，即Arg，Cys，Gln，

His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Thr，Trp，Tyr，Val）并且在DMEM中以高濃度存在（0.5-4mM）。 7種非必需氨基酸（Ala，Asn，Asp，Glu，Gly，Pro，Ser）是在Ham's F-12中提供。

2.2.9谷氨酰胺

谷氨酰胺是蛋白質(zhì)和核糖核苷酸合成的必需前體。它也是用于細(xì)胞快速分裂和利用葡萄糖不佳的細(xì)胞的重要呼吸燃料。然而，谷氨酰胺也有它的缺點(diǎn)：在溶液中不穩(wěn)定，谷氨酰胺分解和代謝導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞有毒的氨的產(chǎn)生和積累，因?yàn)榘辈槐粺o血清和/或無蛋白培養(yǎng)基中的血清蛋白所吸附。要克服這些缺點(diǎn)，人們又開發(fā)了在培養(yǎng)基中使用谷氨酰胺的替代方案。例如，在表達(dá)足量谷氨酰胺合成酶的細(xì)胞中，谷氨酸可以代替谷氨酰胺。最近的一項(xiàng)發(fā)明是使用含有谷氨酰胺的二肽，即丙氨酰-谷氨酰胺和甘氨酰-谷氨酰胺，商品名為GLUTAMAX?。這些二肽更穩(wěn)定

和耐熱，甚至可以對(duì)含有這些物質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌。二肽被細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的肽酶裂解，從而釋放谷氨酰胺和丙氨酸或甘氨酸。因此，谷氨酰胺的可獲得性取決于肽酶活性，這導(dǎo)致較低速率的的谷氨酰胺消耗和氨生產(chǎn)。 GLUTAMAX?可以1：1的摩爾濃度代替谷氨酰胺。

2.2.10微量元素

大多數(shù)微量元素都可以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中獲得。Ham's F-12富含必要的微量元素。

2.2.11 脂類

脂肪酸和脂質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用長期以來被忽視。脂質(zhì)可作為能量儲(chǔ)備，作為細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分，以及在運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)中扮演角色。 一些脂質(zhì)可在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中獲得。但是，建議必需脂肪酸和乙醇胺為添加劑。水溶性添加劑可商品化獲得。血清白蛋白是脂肪酸和脂質(zhì)的載體。必需脂肪酸是幾種無血清培養(yǎng)基配方的組分。

2.2.12 抗生素

應(yīng)盡可能避免使用抗生素。可能會(huì)產(chǎn)生耐抗生素的微生物，抗生素對(duì)細(xì)胞生長和功能也可能有不良影響。

2.2.13黏附因子

大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞需要用于細(xì)胞粘附的特殊的培養(yǎng)基質(zhì)才能在體外存活和生長。塑料培養(yǎng)皿，經(jīng)過特殊處理后在聚苯乙烯表面引入電荷和親水性，例如多聚L（或D）-賴氨酸或鳥氨酸，是最常用的細(xì)胞黏附基質(zhì)。培養(yǎng)平皿上包被其他基質(zhì)如細(xì)胞外基質(zhì)成分或膠原蛋白基質(zhì)，可進(jìn)一步促進(jìn)貼壁細(xì)胞的黏附。

2.2.14滲透壓

盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)滲透壓一定的耐受，滲透壓仍應(yīng)始終仔細(xì)檢查，并且

在適應(yīng)新的細(xì)胞基配方時(shí)，應(yīng)對(duì)滲透壓進(jìn)行補(bǔ)償。

2.3 開發(fā)一種無血清培養(yǎng)基

如上所示，要從細(xì)胞和組織培養(yǎng)基中去除FBS，并仍然保持細(xì)胞粘附、生長和增殖，很重要的是要包括幾種細(xì)胞培養(yǎng)基中的組分（需大量）。圖中1顯示的是一個(gè)“培養(yǎng)基金字塔”。金字塔的底部為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，包括DMEM / Ham's F-12（50：50，v/v），添加有胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（ITS）。要使貼壁細(xì)胞黏附在培養(yǎng)容器底物，應(yīng)考慮包被細(xì)胞外基質(zhì)的成分。細(xì)胞無血清培養(yǎng)通常需要細(xì)胞黏附因子。

培養(yǎng)基配方開發(fā)的下一步是添加特定的激素和生長因子。表皮生長因子（EGF）和糖皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）應(yīng)在大多數(shù)培養(yǎng)基中存在。根據(jù)細(xì)胞類型，還可能需要額外的細(xì)胞特異性生長因子，例如神經(jīng)元所需的神經(jīng)生長因子（NGF）。已經(jīng)證明上皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需要添加升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平激動(dòng)劑。在這方面，毛喉素和霍亂毒素，盡管是強(qiáng)藥劑，被用作體外有絲分裂原。

金字塔頂端代表無血清培養(yǎng)基成分的特異性增加：即添加有脂質(zhì)，抗氧化劑和/或特定維生素。維甲酸（維生素A）是一些上皮類型細(xì)胞所需的添加劑。維生素E（α-生育酚）和抗壞血酸（維生素C）被看作抗氧化劑。其他無血清培養(yǎng)基中的抗氧化劑有β-巰基乙醇（β-ME）和硒（見上文）。

圖1. 開發(fā)無血清培養(yǎng)基的金字塔

2.4 細(xì)胞系對(duì)無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)

有如下幾種方法：

1. 逐步減少血清用量，直到血清比例為0.1%

2. 含血清培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基比例的變化

3. 和方法2相似，只不過采用比例逐漸降低的條件培養(yǎng)基

4. 接種的細(xì)胞已實(shí)現(xiàn)馴化好

3. 促進(jìn)無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和應(yīng)用

3.1 信息來源

在自我開發(fā)之前，應(yīng)先查查數(shù)據(jù)庫，是是否有已經(jīng)開發(fā)好的。市面上現(xiàn)已有450種不同無血清培養(yǎng)基，但只針對(duì)有限的細(xì)胞類型。

3.2 無血清培養(yǎng)基互動(dòng)在線數(shù)據(jù)庫

3.3 驗(yàn)證新的培養(yǎng)基和適應(yīng)的細(xì)胞

在關(guān)于使用FBS和其他動(dòng)物源性添加劑的聲明中（ESAC，2008），ECVAM科學(xué)咨詢委員會(huì)強(qiáng)烈主張開發(fā)新的無血清體外培養(yǎng)方法。此外，如體外使用含血清的培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)基提交給ECVAM進(jìn)行驗(yàn)證，必須提供使用血清的理由。

為了促進(jìn)無血清培養(yǎng)基的使用，ECVAM（替代方法的歐洲驗(yàn)證中心）將鼓勵(lì)無血清培養(yǎng)體系驗(yàn)證的提交者公開他們的無血清方案。已有的替代動(dòng)物成分的培養(yǎng)方法，應(yīng)同含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行比較，確保觀察終點(diǎn)不受影響。

ECVAM網(wǎng)站 (http://ecvam.jrc.ec.europa.eu)有一個(gè)關(guān)于無血清培養(yǎng)基的公開論壇。

3.4 其他活動(dòng)

希望優(yōu)先使用無血清培養(yǎng)基的資助機(jī)構(gòu)可以提供促進(jìn)FBS替代品的激勵(lì)措施。關(guān)于體外培養(yǎng)和工藝的研討會(huì)和會(huì)議，還應(yīng)鼓勵(lì)開展特定研討會(huì)和海報(bào)，交流與無血清培養(yǎng)基有關(guān)的經(jīng)驗(yàn)。研討會(huì)可以由細(xì)胞和組織培養(yǎng)學(xué)會(huì)（例如ESTIV）的工作組籌備。此外，應(yīng)開展無血清細(xì)胞和組織培養(yǎng)價(jià)值的教育，他們也是基礎(chǔ)培養(yǎng)技術(shù)教育和培訓(xùn)的一部分。

支持協(xié)調(diào)行動(dòng)，促進(jìn)與特定細(xì)胞和組織培養(yǎng)相關(guān)的信息交流，可以在國家，歐洲和國際層面進(jìn)行。

4. 無血清研究舉例

4.1 血小板裂解物

下面報(bào)道了使用人血小板裂解物（PL）作為血清替代物。PL是由保存的人供體血小板濃縮物制備。在低滲鹽水中凍融可實(shí)現(xiàn)血小板的**活化。血小板顆粒生長因子的釋放程度可通過ELISA和Western Blotting測(cè)定。PL的生長促進(jìn)能力和促有絲分裂能力，可在眾多有選擇的連續(xù)細(xì)胞系上進(jìn)行測(cè)試，這些細(xì)胞系的生長特征、表型和分化終點(diǎn)應(yīng)已很好地確定。 PL+DMEM支持細(xì)胞的生長、增殖和分化，通過穹頂形成評(píng)估近端小管樣LLC-PK 1（豬腎）和HK-2（人腎）細(xì)胞，而遠(yuǎn)端小管樣MDCK（狗腎）細(xì)胞在血小板提取物添加的無血清DMEM / Ham-F-12中生長良好。除貼壁上皮細(xì)胞系外，不依賴貼壁的Raji人淋巴瘤細(xì)胞也進(jìn)行了研究。 PL完全支持懸浮Raji細(xì)胞的生長和增殖。在所有細(xì)胞系中，監(jiān)測(cè)增殖是通過確定上皮培養(yǎng)物的細(xì)胞密度（每個(gè)生長區(qū)域的細(xì)胞數(shù)）來確定，以及刃天青或WST-8測(cè)定。生長率和增殖率在含10％FBS或5％PL的培養(yǎng)基條件下，二者相當(dāng)。為了確定PL的促增殖潛力，細(xì)胞外MAPK（ERK1 / 2）的刺激進(jìn)行了檢測(cè)。GR激活MAPK信號(hào)通路，使下游ERK1/2磷酸化。將PL添加到靜止?fàn)顟B(tài)的LLC-PK1培養(yǎng)物中，幾分鐘內(nèi)即可發(fā)生ERK1/2的磷酸化和激活。FBS對(duì)應(yīng)的ERK1/2活化的時(shí)程相同。數(shù)據(jù)顯示，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)中，PL替代FBS是有價(jià)值的，具有高潛力。

4.2無血清聚集腦細(xì)胞培養(yǎng)物

涉及腦細(xì)胞的3D培養(yǎng)，這里略。

4.3器官型腦切片培養(yǎng)和化學(xué)限定的無血清培養(yǎng)基 Neurobasal與B27

器官型腦切片培養(yǎng)可以生長數(shù)周和數(shù)月，保留其基礎(chǔ)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組成和連接，并越來越多地用作研究神經(jīng)退行性疾病機(jī)理和治療的模型。在1990年代中期，含25％馬血清的Optimem培養(yǎng)基被無血清的Neurobasal和B27添加劑所替代。

細(xì)胞起始是在Serum Optimem培養(yǎng)2天，之后即用無血清培養(yǎng)，旨在避免未知生長因子和血清批間差異的影響。含B27的Neurobasal的使用效果很好，直到2000年初發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物種的壞死洞。2010年，一個(gè)美國小組公布了N21的配方，它是對(duì)B27配方的優(yōu)化。Sigma-Aldrich也在2010年初推出一系列神經(jīng)元和干細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，Stemline TM，其中包含了所有必需的添加劑，可和Serum Optimem進(jìn)行比較。

4.4 化學(xué)限定培養(yǎng)基和血清培養(yǎng)基有時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞采用不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行增殖

含B27的Neurobasal培養(yǎng)基為化學(xué)限定培養(yǎng)基，可長期培養(yǎng)神經(jīng)元，而成纖維細(xì)胞或星型細(xì)胞不過度生長。然而，采用該培養(yǎng)基原代培養(yǎng)有時(shí)會(huì)產(chǎn)生不一致的結(jié)果。例如，一些膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元生長所采用的信號(hào)通路，會(huì)與在血清培養(yǎng)基中生長不一樣。

4.5 人小腸細(xì)胞Caco-2在無血清培養(yǎng)基中功能分化所需培養(yǎng)條件的優(yōu)化

雖然人Caco-2細(xì)胞系代表了**和最廣泛使用的可吸收腸道細(xì)胞模型，該細(xì)胞分化功能仍顯示出高度的異質(zhì)性，這主要由于培養(yǎng)流程的不同。胎牛血清（FBS）是產(chǎn)生變異的重要來源。因此多年來已經(jīng)使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細(xì)胞。Halleux和Schneider于1991年開發(fā)出一種用于Caco-2細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，它改進(jìn)自肝細(xì)胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基，添加有胰島素，表皮生長因子，白蛋白-亞麻酸，氫化可的松和三碘甲狀腺原氨酸（T3）。細(xì)胞生長在包被有膠原蛋白的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）濾膜上，作為腸道屏障的模型。并在培養(yǎng)15天后顯示出腸細(xì)胞的許多分化功能，正確的極化和細(xì)胞側(cè)壁通透性的降低，表明建立了有正常功能的緊密連接。不久之后，Jumarie和Malo獲得了接種在塑料基質(zhì)上、采用ITS添加的DMEM培養(yǎng)的分化的Caco-2細(xì)胞。該限定培養(yǎng)基可是使細(xì)胞3周后正常分化，僅有蔗糖酶活性低于血清培養(yǎng)的細(xì)胞，但可加入T3提高其活性。

一種包含ITS和脂質(zhì)的無血清培養(yǎng)基被用于分化Caco-2細(xì)胞。為提高該培養(yǎng)基性能，試驗(yàn)了一些不同的添加劑，（A）胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，硒（ITS）和脂質(zhì)混合物（油酸鹽，棕櫚酸鹽，膽固醇和BSA作為載體）; （B）來自ITS的生長因子和激素的成分限定的混合物。

5.結(jié)論

使用血清培養(yǎng)細(xì)胞和組織是有問題的，它同時(shí)存在有倫理和科學(xué)的原因。因而推薦使用無血清培養(yǎng)基，并且**是無動(dòng)物成分和化學(xué)限定的培養(yǎng)基。

因此建議采用"不，除非”的原則，即不使用血清，除非還沒開發(fā)出無血清培養(yǎng)基。開發(fā)無血清培養(yǎng)基，一些成分是必需的哦，另一些則是有用的。而且采用了一些方法使細(xì)胞適應(yīng)新的無血清培養(yǎng)基。

對(duì)于新的血清的驗(yàn)證要注意，應(yīng)使原先研究的標(biāo)志物在細(xì)胞和組織上仍然表達(dá)。現(xiàn)在已經(jīng)有了成功地開發(fā)無血清培養(yǎng)基的方法，文中的模型顯示，開發(fā)并不是一項(xiàng)容易的任務(wù)，還存在一些問題。通過數(shù)據(jù)庫、會(huì)議和網(wǎng)絡(luò)寫作，廣泛的交流有助于開發(fā)出新的無血清培養(yǎng)基配方。

附錄

開發(fā)無血清培養(yǎng)基的建議

1.開發(fā)無FBS培養(yǎng)基時(shí)，從適當(dāng)?shù)幕A(chǔ)培養(yǎng)基開始。50:50（v/v）DMEM和Ham's F-12和ITS是一些研究成功的選擇。

2.當(dāng)使用谷氨酰胺時(shí)，應(yīng)加入濃度為2-4mM的谷氨酰胺。也對(duì)于一些細(xì)胞系，也可以添加Glutamax I TM（L-Ala-L-Gln）。

3.必要時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞類型特異性的生長因子，激素，維生素，微量元素和脂質(zhì)。

4.注意滲透壓。

5.對(duì)于某些研究或細(xì)胞類型，可以添加特定蛋白質(zhì)。

6.有些必需脂肪酸，不存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，可能需要添加。

7.**不使用抗生素。

8.對(duì)于一些細(xì)胞類型和原代培養(yǎng)，可以使用黏附基質(zhì)。許多無血清配方需要預(yù)先包被培養(yǎng)皿。

9.對(duì)于生物反應(yīng)器和灌注培養(yǎng)，可以添加剪切力保護(hù)劑（Pluronics F68）。

10.細(xì)胞馴化應(yīng)小心進(jìn)行。

11.始終檢查細(xì)胞的性能是否發(fā)生了變化，以及研究終點(diǎn)是否受到影響。

12.成功后，與同事和通過現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)庫分享你的配方。