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蛋白质组学再立战功：揭示了BCAT1在癌细胞转移中的重要作用

2021-12-03 14:38来源：威正翔禹|缔一生物

癌症是对人类健康威胁**的疾病之一。根据世界卫生组织（WHO）的统计，2018 年全球新发癌症病例达到 1,807 万例，其中肺癌 209 万例，发病率名列前茅。

中国癌症新发患者人数也在逐年增加，根据国家癌症中心发布的全国最新癌症数据，2015 年全国新发恶性肿瘤病例数约 392.9 万例，肺癌位居发病首位。


肺癌患病率逐年攀升，转移是肺癌高死亡率的主要原因之一，严重危害人类公共健康。


肺癌是如何转移的？

哪些因素会影响肺癌转移？

如何断了癌细胞后路，避免其转移？


这些问题一直困扰着研究人员。


近日，《Theranostics》上发表了一篇标题为：“Proteomic analysis of lung cancer cells reveals a critical role of BCAT1 in cancer cell metastasis”的论文，或许可以在一定程度上回答上述问题。



图片来源：https://www.thno.org/v11p9705.htm

点击文末阅读原文，即可获得完整文献


浓缩精华版：


研究人员发现：在转移性肺癌细胞和肺癌患者的转移性组织中，分支链氨基酸代谢的关键酶BCAT1蛋白水平呈现过表达状态。通过数据分析分析得出结论：BCAT1转录的增加，与肺癌患者总生存率较低之间存在关联性。



感兴趣的小伙伴可以接着往下看，有详细版。


图片


在过去的十年中，基因组测序越来越多地被应用到转移性肿瘤突变谱的研究中 [1，2]。已有一些研究，对肺癌患者标本进行了全面的蛋白质基因组学研究，绘制了呈现了原发肿瘤相对于肿瘤旁“正常”组织的蛋白质组图 [3，4]。然而，关于转移性肺癌的蛋白质组水平的相关研究仍然不足。


我们已经知道，氨基酸代谢在肿瘤发生和转移中起重要作用。


氨基酸密码子对照表


支链氨基酸(BCAA)到α-酮戊二酸(α-KG)的转氨基反应，由胞质BCAT1和线粒体BCAT2两种类型的bcat基因催化。该反应产生谷氨酸，而谷氨酸又可以被肿瘤细胞优先利用以促进生存[5]。


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由此得到的支链酮酸(BCKA)进一步分解为乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，它们是TCA循环的中间体[6]。BCAT1的过表达与髓样白血病[7]、胶质瘤[8]和非小细胞肺癌[9]的癌症进展有关，而增加BCAA摄取对于维持NSCLC[10]的肿瘤发生很重要。然而，BCAT1的表达过程，是否在转移性肿瘤中出现紊乱？在潜在的迁移过程中发挥作用？这些目前尚不清楚。


为了确定与肺癌转移状态相关的蛋白质组学的变化，研究人员用到了一种同位素标记(SILAC：细胞培养稳定同位素标记，在细胞培养过条件下，用含有轻、重同位素标记氨基酸的培养基，进行细胞培养，若干代后，细胞中的蛋白质被稳定标记上同位素)的定量质谱分析。


利用原发性肺腺癌A549细胞系(指定L0)和L0细胞进行了三轮BALB/c Nude小鼠体内选择，产生脊柱转移细胞(指定L2和L6)[11]。然后，分别在“轻、中、重”三种同位素标记的培养基进行培养，稳定标记后进行质谱定量分析。


得到结果1

  • 转移细胞显示出与原代细胞不同的蛋白质表达谱。相对于L0细胞，L6细胞中有74个蛋白、L2中有86个蛋白发生了显著变化。

  • 在显著改变的蛋白质中，33个在两种转移细胞系(L2和L6)中出现重叠。

  • 最显著富集的通路是氨基酸代谢过程（1C-D）BCAT1, BCAA代谢速率限制酶，是转移细胞中最一致的上调蛋白。并且，上调蛋白的mRNA水平也升高。


随后，作者又比较分析了四对，来自肿瘤患者样本的原发和转移性肿瘤组织进行蛋白质组学。


采用串联质谱(TMT)标记和质谱定量分析方法检测蛋白表达，利用TCGA数据进行分析。


得到结果2

  • 鉴定出14个变化显著的蛋白。其中大部分改变的蛋白参与免疫反应通路，包括干扰素- γ和PPAR信号通路。这些改变的蛋白也存在于先前SILAC质谱分析得到的数据库中。

  • 患者的总生存期(OS, n = 241)与BCAT1表达呈负相关 ，表明，BCAT1可能是肺癌进展的一个弱预后标志物。


接着，研究人员利用A549细胞系，进行了一系列细胞学实验以及分子实验：Western blot、trans-well、RNA干扰等，以及小鼠体内实验，进一步探究BCAT1在转移中的作用。


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得到结果3

  • 与使用原代和转移性A549细胞株的SILAC蛋白质组学结果一致，Western blot检测BCAT1发现在转移性细胞中显著增加。

  • L2和L6细胞的迁移能力明显高于原代L0细胞，说明转移性更高。

  • 稳定表达shRNA对抗BCAT1 (shBCAT1)的L2和L6细胞，并进行了反转录实验。表达shBCAT1的细胞的迁移速度明显慢于表达重组shRNA的对照细胞。

  • 体内实验发现：与对照组细胞相比，接种表达shBCAT1的L6细胞的小鼠的癌细胞转移率降低。

  • 对主要转移部位(股骨和胫骨)的Micro-CT分析显示，接种转移细胞的小鼠有严重的骨性侵蚀(与L6和L0细胞相比)，而接种表达shBCAT1的转移细胞的小鼠骨性侵蚀小得多。

  • 最终得出结论：敲除BCAT1后，体外转移的L2和L6细胞迁移能力减弱，体内骨转移的严重程度大大降低，几乎达到L0水平。BCAT1的过表达可能驱动肺癌细胞转移，而降低BCAT1的表达抑制了癌细胞的迁移和转移。


为了深入了解BCAT1介导的转移的机制，研究人员检测了与干细胞和上皮-间质转化(EMT)相关基因的表达。


得到结果4

  • 在L2和L6细胞中，干细胞转录因子SOX2在mRNA和蛋白水平均显著升高。



SOX2是维持胚胎干细胞和肿瘤干细胞可塑性的转录因子，它的过表达促进了肺癌的转移。在已有研究中，SOX2的表达增加可能会使L0细胞进入低分化状态，迁移能力增加。


文章作者从先前的研究[11]中重新分析了这些A549细胞的RNA-seq数据。


得到结果5

  • SOX2下游的许多基因在L2和L6细胞中均显著上调，包括Wnt信号基因NOTCH3、DVL1、DVL2和致癌基因KLF4。

  • 与SOX2相互作用的转录因子，包括FOXK1和FOXC1，增加了表达。

  • 最显著富集的通路是氨基酸代谢过程（1C-D）BCAT1, BCAA代谢速率限制酶，是转移细胞中最一致的上调蛋白。并且，上调蛋白的mRNA水平也升高。


然而，在先前的SILAC实验结果中，转移细胞中包括CTNNB1和DVL2在内的Wnt信号蛋白减少。He等人之前的一项研究也表明，过表达SOX2可能通过上调A549细胞[12]中的GSK3β，导致Wnt/β-catenin信号通路的抑制。


因此，作者假设SOX2通过β-catenin抑制Wnt信号，维持转移细胞的未分化状态。


为了验证这一假设，研究人员用几种不同的方式：荧光成像、流式细胞术、Western blot、Real-time PCR，确定了BCAT1在转移性A549细胞中促进了SOX2的表达，这一新的途径可能是肺癌细胞干性的重要调控因子。


得到结果6

  • α-KG水平确实在L2和L6细胞中降低，而降低BCAT1的表达部分恢复了α-KG水平。

  • 谷氨酸、KIV和BCAAs在转移细胞中积累。

  • 随着降低BCAT1的表达，这些氨基酸和酮酸的水平也会降低。由于α-KG是DNA去甲基化酶TET2的辅助因子，降低α-KG浓度可能导致靶基因启动子区域的高甲基化，从而沉默这些基因。

  • 检测了DNA甲基化，发现L2和L6细胞中5-甲基脱氧胞嘧啶(5mdC)显著升高，表明DNA有整体高甲基化的趋势。

  • 在表达sh-BCAT1的L2和L6细胞中，5mdC大量减少。此外，在L2和L6细胞中观察到组蛋白甲基化增加的现象。


TET2调控的许多基因中有编码micro-RNAs的基因，已有研究表明miR200家族成员是SOX2的负调控因子。


这提出了一种可能性：


即bcat介导的α-KG的减少导致miR200家族成员的高甲基化，并解除了SOX2的翻译抑制。



分析显示miR200c的表达与BCAT1呈负相关。



有报道称：miR-200c表达的丢失在NSCLC中诱导了侵袭性表型。研究人员测量了miR200c，以及其他后续实验。


得到结果7

  • miR200c在L2和L6细胞中观察到统计学上显著的大幅减少。

  • 敲除BCAT1可增加miR200c的表达。

  • 另外两种可以靶向SOX2 mRNA的microRNA：miR429和miR21-5p，在BCAT1敲除后也表现出类似的效果，尽管它们在转移细胞中表达水平不同。

  • 添加DM-α-KG(一种能够穿透细胞膜的α-KG类似物)，可以在L2和L6细胞中以剂量依赖性的方式降低SOX2的表达。

  • DM-α-KG治疗也增加了转移细胞中的miR200c。


因此，研究人员认为：

BCAT1-α-KG-miR200c-SOX2

调控途径成立！


综上所述，研究发现BCAT1在转移性肺癌细胞中表达上调，调控其迁移转移，并与不良预后相关。该研究确定了一条新的通路，其中α-KG是转移性肺癌细胞中BCAT1和SOX2表达转录后调控之间的关键代谢信号传导中间体。


这些发现可能为靶向肺癌转移过程的治疗开辟新的策略。



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参考文献


[1] Zehir A, Benayed R, Shah RH, Syed A, Middha S, Kim HR. et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat. Med. 2017;23(6):703-713


[2]Yaeger R, Chatila WK, Lipsyc MD, Hechtman JF, Cercek A, Sanchez-Vega F. et al. Clinical sequencing defines the genomic landscape of metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 2018;33(1):125-136.e3


[3]Xu J-Y, Zhang C, Wang X, Zhai L, Ma Y, Mao Y. et al. Integrative proteomic characterization of human lung adenocarcinoma. Cell. 2020;182(1):245-261.e17


[4]Chen Y-J, Roumeliotis TI, Chang Y-H, Chen C-T, Han C-L, Lin M-H. et al. Proteogenomics of non-smoking lung cancer in East Asia delineates molecular signatures of pathogenesis and progression. Cell. 2020;182(1):226-244.e17


[5]Yi H, Talmon G, Wang J. Glutamate in cancers: from metabolism to signaling. J Biomed Res. 2019;34(4):260-270


[6]Ichihara A, Koyama E. Transaminase of branched chain amino acids. I. Branched chain amino acids-alpha-ketoglutarate transaminase. J Biochem. 1966;59(2):160-9


[7]Hattori A, Tsunoda M, Konuma T, Kobayashi M, Nagy T, Glushka J. et al. Cancer progression by reprogrammed BCAA metabolism in myeloid leukaemia. Nature. 2017;545(7655):500-504

[8]T?njes M, Barbus S, Park YJ, Wang W, Schlotter M, Lindroth AM. et al. BCAT1 promotes cell proliferation through amino acid catabolism in gliomas carrying wild-type IDH1. Nat. Med. 2013;19(7):901-908


[9]Lin X, Tan S, Fu L, Dong Q. BCAT1 overexpression promotes proliferation, invasion, and Wnt signaling in Non-Small Cell Lung Cancers. Onco Targets Ther. 2020;13:3583-3594

[10]Mayers JR, Torrence ME, Danai LV, Papagiannakopoulos T, Davidson SM, Bauer MR. et al. Tissue of origin dictates branched-chain amino acid metabolism in mutant Kras-driven cancers. Science. 2016;353(6304):1161


[11]Cai X, Luo J, Yang X, Deng H, Zhang J, Li S. et al. In vivo selection for spine-derived highly metastatic lung cancer cells is associated with increased migration, inflammation and decreased adhesion. Oncotarget. 2015;6(26):22905-22917


[12]He J, Shi J, Zhang K, Xue J, Li J, Yang J. et al. Sox2 inhibits Wnt-β-catenin signaling and metastatic potency of cisplatin-resistant lung adenocarcinoma cells. Mol Med Rep. 2017;15(4):1693-1701



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